Citrometria a flusso è un metodo di conteggio, selezione e isolamento di particelle,le quali dopo essere state marcate con un colorante fluorescente in modo specifico,vengono singolarmente passate attraverso un sistema rivelatore ottico a flusso laminare e quindi conteggiate. Attraverso i parametri derivati da questi conteggi è possibile analizzare molte caratteristiche delle particelle,dove le proprietà in analisi possono essere selezionate dalla marcatura specifica.
Questa tecnica consta di tre componenti principali :
sistema fluidico che controlla la captazione cellulare e il flusso cellulare,in questo processo le cellule in sospensione (sangue periferico,aspirato midollare, cellule in colture) vengono inniettate in singola fila nella camera di flusso
sistema ottico che interroga le cellule mentre attraversano un raggio laser, ogni singola cellula che attraversa un fascio di luce polarizzata del laser che riflette la luce e genera dei segnali,che vengono raccolti, filtrati e amplificati.
Sistema elettronico che controlla gli strumenti e raccoglie, raffigura ed analizza i dati, un softwer converte i segnali in valori digitali e li invia al pc quindi si ha una rappresentazione grafica e statistica.
Vediamo il funzionamento di ciascun elemento della citometria analizzandolo pezzo per pezzo in maniera dettagliata
Le cellule di una popolazione eterogenea( può essere sangue periferico, cellule in colture ecc.) vengono aspirate dalla provetta per mezzo di un ago e spinta da aria compressa in un capillare,all’uscita del quale incontra il liquido “guaina” e dopo aver attraversato il filtro salino di circa 0,45µ per eliminare le impurità viene inserito attraverso una pressione generata da una pompa ad aria nel citofluorimetro. Il liquido guaina guida il campione nella camera del flusso dove le cellule vengono separate, e trasportate fino alla regione del nozzle fino alla regione ottica.
All’interno della camera di flusso il campione viene avvolto dal liquido guaina ed entra in una prma regione chiamata nozzle dove viene sottoposto a un processo definito focalizzazioneidrodinamica
Dopo aver attraversato il punto di misura il campione prosegue nel capillare trasportato dalla guaina fino allo scarico nella tanica di rifiuto.
Dopo la camera di flusso ogni singola cellula viene poi attraversata da un fascio di luce che eccita i fluorocromi e determina l’emissione di un segnale fluorescente, un segnale passando attraverso un sistemi di filtri e specchi raggiunge un rivelatore. Viene a questo punto trasformato da analogico a digitale e inviato all’analizzatore che elabora il dato e lo trasforma in un grafico, attraverso piastre di deflessione le cellule analizzate possono essere raccolte separatamente tramite un processo definito”sorting”.
La parte fondamentale del sistema è il banco ottico di lettura, costituito da una sorgente di luce monocromatica di lunghezza d’onda =633 nm. (nella maggior parte degli strumenti viene impiegato un laser a ioni di Argon con lunghezza d’onda di 488nm(blu))
Le cellule, dopo specifica colorazione, vengono trasportate con un fluido laminare nella cella di lettura dove attraversano, una dopo l’altra in un flusso focalizzato idrodinamicamente, il raggio di luce monocromatica.
Opportuni sistemi ottici (fotodiodi, fotomoltiplicatori) rilevano la luce diffusa a diverse angolazioni da ciascuna cellula
Rifrazione Frontale (Forward Scattered Light)
Rifrazione Laterale (Side Scattered Light)
Fluorescenza (Side Fluorescence)
RIFRAZIONE FRONTALE (“Forward Scatter”) La rifrazione frontale è misurata da un fotodiodo posto frontalmente al percorso ottico della luce laser. Quando il raggio luminoso monocromatico colpisce le cellule, una parte dei suoi raggi viene deviata in diverse direzioni e angolazioni. La quantità di luce che riesce a raggiungere il fotodiodo rilevatore è direttamente proporzionale alle dimensioni (volume) della cellula. La misura di rifrazione frontale è utilizzata per l’analisi di:
- Globuli Bianchi e Granulociti Basofili
- Reticolociti e Piastrine
- Eritroblasti .
RIFRAZIONE LATERALE (“Side Scatter”)
La rifrazione laterale è rilevata da un tubo fotomoltiplicatore posto in posizione ortogonale alla sorgente luminosa. Esso quindi raccoglie in modo selettivo, per mezzo di uno specchio dicroico, la luce diffratta da ciascuna cellula ad un angolo di 90 gradi rispetto alla luce incidente. A tale angolazione la luce rifratta dalla cellula dipende da:
- Regolarità di forma del nucleo
- Densità della cromatina nucleare
- Granularità del citoplasma
La quantità di luce rifratta lateralmente da un granulocita, pertanto, è molto più elevata della quantità di luce rifratta da un linfocita per la maggiore quantità di granulazioni citoplasmatiche e la maggiore irregolarità di forma del nucleo.
La misura di rifrazione laterale e utilizzata per l’analisi di:
- formula leucocitaria
Globuli Bianchi e Granulociti Basofili
I segnali di fluorescenza emessi dalla cellula vengono portati ciascuno a un diverso sensore, il quale trasforma l’energia luminosa raccolta i cosiddetti fotoni in intensità di corrente gli elettroni e li amplifica in modo da creare un logaritmo. Va precisato che prima dell’acquisizione di un campione , si va a stabilire un valore soglia al di sotto del quale il nostro strumento considera un processo come inesistente e quindi non lo va ad includere nella nostra analisi.
L’elaborazione dei dati e’ eseguita grazie al computer collegato allo strumento,
che tramite specifici software provvede a tradurre i segnali in grafici e alla loro rappresentazione su display video in tempo reale.
I dati da noi raccolti per mezzo di questo apparecchio vengono evidenziati per attraverso delle rappresentazioni grafiche quali possono essere o ISTOGRAMMI dove in ascissa viene riportata l’intensità di fluorescenza e in ordinata il numero di cellule che esprimono o meno l’antigene