In campo microbiologico è importante riuscire a coltivare i microorganismi in laboratorio, ciò è reso possibile mediante l’utilizzo di adeguati terreni di coltura. Terreni specializzati sono inoltre essenziali per l’isolamento e l’identificazione dei vari microorganismi, per testare la sensibilità degli antibiotici, per l’analisi delle acque, degli alimenti e così via. Sebbene tutti i microorganismi esigano, per la loro crescita, la disponibilità di fonti di energia, di carbonio, di azoto, di fosforo, di zolfo e di vari minerali, l’esatta composizione di un terreno ottimale, dipende senza dubbio dal tipo di microorganismo che si desidera coltivare, dato che le esigenze nutrizionali, variano da una specie all’altra. Per la scelta di un appropriato terreno di coltura, e spesso utile conoscere l’habitat normale del microorganismo, e ciò perché le sue esigenze nutrizionali riflettono l’ambiente naturale che lo circonda .I microrganismi vivono in natura in popolazioni che sono dette miste, costituite da un’ampia varietà di differenti tipi di microbi. I microrganismi necessitano di ambienti favorevoli e di sostanze nutritive adatte. Il terreno di coltura deve contenere principi nutritivi essenziali per lo sviluppo di una coltura microbica e deve fornire condizioni ambientali adatte alla crescita, vale a dire condizioni ottimali di: pH, pressione osmotica, ossigeno atmosferico,ecc.

I terreni di coltura contengono le seguenti categorie di ingredienti:

• Peptoni e idrolisati: sono miscele di amminoacidi liberi e polimerizzati, facilmente utilizzabili dalle cellule batteriche. Sono ottenuti dalla digestione enzimatica e rappresentano la principale fonte di azoto organico.
• Carboidrati: rappresentano la principale fonte di carbonio organico e possono essere utilizzati nelle prove di identificazione basate sulla fermentazione. I principali sono glucosio, saccarosio, lattosio.
• Sali inorganici: hanno la funzione di rifornire le cellule degli elementi inorganici essenziali, di garantire adeguata osmolarità e di tamponare il terreno.
• Indicatori: sono le sostanze coloranti (fenolo, blu di bromo fenolo, rosso fenolo, verde di bromo cresolo, ecc.) che permettono di seguire il metabolismo fermentativo del batterio in esame, determinando il viraggio di colore del terreno a valori critici di pH.
• Solidificanti: la sostanza più usata per solidificare i terreni di coltura è l’agar, un estratto di diversi generi di alghe rosse, che presenta proprietà particolarmente idonee all’impiego in microbiologia. Esso fluidifica intorno a 96-100°C e solidifica a temperature inferiori ai 45°C. È trasparente quindi non interferisce con le altre caratteristiche colturali, non inibisce la crescita e non viene digerito dagli enzimi batterici.
• Sostanze selettive: composti chimici la cui presenza, in concentrazioni adeguate, risulta tossica per alcuni microrganismi, mentre è ben tollerata da altri, di cui viene favorita la crescita.
• Sostanze di arricchimento: sangue lisato, emoglobina, latte disidratato, gelatina, vitamine. Queste sostanze sono necessarie per la crescita di batteri più “esigenti” dal punto di vista nutrizionale.

 

Classificazione dei terreni di coltura

terreni di coltura si distinguono in liquidi e solidi.

 (terreno solido a sinistra terreno liquido a destra)

Terreni liquidi

Sono una semplice soluzione in acqua dei componenti nutritivi essenziali allo sviluppo microbico  e vengono chiamati anche brodi.

Terreni solidi

I più antichi sono il siero di sangue coagulato e la patata (patata glicerinata per i micobatteri). Oggi si ricorre all’aggiunta dell’agar. I terreni solidi sono indispensabili per l’isolamento di colture batteriche pure.

 

In rapporto alla composizione chimica si possono classificare in

 

Terreni GENERICI

Servono alla coltivazione di batteri senza particolari esigenze nutritive (Es. “brodo normale”, o “brodo semplice”; “brodo normale solidificato con agar” o “agar semplice”). Di uso comune sono il “brodo nutritivo” e l'”agar nutritivo”. Contengono peptoni, (0,5%); estratto di carne, NaCl e tampone fosfato (pH ~ 7,0).

 

Terreni sintetici

Contengono soltanto le sostanze organiche e inorganiche  di cui il microrganismo coltivato  necessita e la loro composizione è pertanto nota.

Si utilizzano quando si conoscono tutti i fattori di crescita del microrganismo  in esame.

 

Terreni complessi

Si tratta di terreni ricchi di substrati organici nei quali non tutti i costituenti o le loro quantità sono noti. Estratti di carne, di organo (brodo, fegato per anaerobi),  siero di sangue sono fra i componenti più frequenti. Questi mezzi di coltura risultano di estrema utilità,dato che un unico terreno complesso può essere sufficientemente ricco e completo da soddisfare le esigenze nutrizionali di molti microrganismi differenti. Per di più, l’utilità di questi terreni si riflette nel fatto che spesso le esigenze nutrizionali di un determinato microorganismo sono sconosciute, per cui è difficile allestire un terreno definito.

 

In rapporto alla funzione si distinguono in

 

Terreni di arricchimento

Terreni poveri che consentendo la sopravvivenza ai microrganismi di una sola specie, di fatto ne arricchiscono la popolazione a scapito di altre.

 

Terreni differenziali

In questi terreni la presenza di particolari indicatori consente di riconoscere le singole specie batteriche dalle caratteristiche macroscopiche delle colonie.

 

TERRENI SELETTIVI

Favoriscono la crescita di alcune specie ed inibiscono quella di altre. Si ottengono mediante l’aggiunta ai terreni nutritivi di sostanze inibenti quali antibiotici, coloranti e sali. Sono impiegati per isolare le singole specie da materiali plurimicrobici.

 

Tecniche di semina

 

Il materiale da cui partire per allestire colture microbiche può essere rappresentato da campioni naturali, ceppi standard di riferimento, colture pure isolate. La scelta delle tecniche di prelievo, dell’inoculo e di semina successiva è determinata dalle condizioni in cui si presenta il campione e dallo scopo per cui vengono predisposte le varie colture. Comunque qualsiasi sia il tipo di procedura adottata, questa deve essere condotta in condizioni di sterilità per evitare contaminazioni di microrganismi provenienti dall’ambiente.

L’inclusione consiste nel trasferimento di volumi precisi di campioni liquidi nelle piastre Petri. Successivamente vengono riempite con un terreno agarizzato che determina l’intrappolamento delle singole cellule nel terreno. Ogni cellula, moltiplicandosi, origina una popolazione di cellule visibile ad occhio nudo, indicata con il termine colonia.

Le colonie singole vengono ottenute anche mediante semina per striscio. In questo caso si utlizzano piastre contenenti un terreno già solidificato. Il prelievo dell’inoculo viene effettuato con l’ansa. Prima di effettuare il prelievo l’ansa viene sterilizzata sul bunsen e fatta raffreddare asetticamente per non rischiare di uccidere i microrganismi dell’inoculo. La semina va effettuata con l’ansa strisciandola delicatamente sul terreno della piastra con movimenti a zig zag.

La tecnica di semina per infissione si utilizza, mediante ago, per inoculare i terreni solidificati in provetta. L’ago consente di inserire le cellule batteriche lungo la linea verticale, in profondità e quindi permette lo sviluppo dei batteri anaerobi e favorisce l’osservazione delle forme mobili che manifestano una crescita diffusa a partire dalla linea dell’inoculo.

 

 

Incubazione

 

Processo che consente di operare in condizioni costanti e controllate di temperatura e di pressione. L’incubazione dei batteri aerobi e anaerobi facoltativi si realizza per mezzo dell’impiego di armadi termostatici o di bagnomaria termoregolati. In entrambi i casi possono essere garantite la temperatura ottimale di crescita e l’ossigenazione delle colture.

Per gli anaerobi obbligati che non solo non crescono in presenza di ossigeno atmosferico, ma vengono uccisi dall’esposizione all’ossigeno, tutte le operazioni dal prelievo, trasporto e conservazione del campione, alla semina e incubazione dello stesso, devono essere condotte escludendo la presenza di ossigeno