(questa parte è stata estrapolata dal sito anpat.drmm.uniud.it/images/pdf/colorazione.pdf)
Scopo della colorazione in istologiaLa colorazione è un procedimento che aumenta il contrasto presente tra diverse strutture cellulari, tale da permetterne il riconoscimento nelle sezioni istologiche.
Meccanismi della colorazione
I meccanismi con cui si può impartire una colorazione a preparati di cellule e tessuti sono molteplici, ne ricordiamo alcuni tra i più usati:
Colorazioni fisiche (SUDAN – Oil Red):
Sostanze colorate possono sciogliersi selettivamente in strutture del preparato, senza che siinstaurino legami chimici tra le molecole colorate e quelle del preparato stesso.
Colorazioni chimiche:
a) Composti colorati possono formarsi per reazioni chimiche tra molecole del tessuto ereagenti NON colorati;
b) Coloranti in soluzione possono fissarsi a strutture microscopiche mediante legami forti(legami covalenti, legami ionici) o legami deboli (ponti idrogeno, forze di Van der Waals).
Cosa si intende per colorante
Per “colorante” si intende una molecola solubile e fornita di colore proprio, capace di legarsi stabilmente a substrati cellulari e tessutali.TUTTI I COLORANTI POSSONO ESSERE SUDDIVISI PER LA LORO ORIGINE IN:
1) naturali animali (es: il carminio ricavato dalla cocciniglia);
2) naturali vegetali (es: l’ematossilina ricavata dal legno di campeggio);
3) artificiali (denominati anche colori di anilina).
Qual è la struttura dei coloranti?
Il cromoforo (gruppo di atomi capaci di conferire colore a una sostanza) e l’auxocromo(gruppo chimico che introdotto in una sostanza colorata, la tarsforma in sostanza in grado dicolorare), che insieme formano il colorante completo. Nel caso di “fluorocoloranti”, si parlarispettivamente di fluoroforo e di auxofluoroforo.
CROMOFORO:
Il cromoforo è un composto capace di assorbire radiazioni elettromagnetiche visibili (lunghezze d’onda nel visibile, da 790 nm a 360 nm).Il colore che esso riflette (o trasmette) è correlato a quello assorbito.
ESEMPIO:
1) una sostanza che appare di colore giallo-arancione ha spettro di assorbimento nel bluvioletto;
2) una sostanza che appare verde ha uno spettro di assorbimento nel rosso.
AUXOCROMO:
L’auxocromo è un gruppo chimico ionizzabile, unito covalentemente al cromoforo. E’responsabile:
1) della solubilità in acqua del colorante;
2) della sua ionizzabilità;
3) della capacità di contrarre legami stabili con le sostanza tessutali.
A seconda della carica assunta in soluzione, l’auxocromo può essere acido (quando ionizzacome anione) o basico (quando ionizza come catione). Questa caratteristica del cromoforo genera la fondamentale distinzione dei coloranti istologici in acidi e basici.
Gli auxocromi acidi sono il gruppo solfonico (-SO3H), quello carbossilico, quello idrossilico.
Gli auxocromi basici sono il gruppo amminico ed i suoi derivati ed i metalli. Le soluzioni hanno pH basico nel caso di coloranti acidi e pH acido nel caso di coloranti basici. Esistono poi coloranti neutri formati da due ioni coloranti di carica opposta.
LegameLegame tra coloranti e substrati
Il principale tipo di legame tra colorante e substrato è quello ionico. In istochimica esistono anche reazioni che danno luogo alla formazione di legami covalenti o semicovalenti.Legami deboli non sono in genere alla base di colorazioni istochimiche.
1) Legame covalente puro: messa in comune di elettroni tra atomi dello stesso elemento (atomi uguali);
2) Legame covalente polare: messa in comune di elettroni tra atomi di elementi diversi(che hanno diversa elettronegatività);
3) Legame covalente dativo: messa in comune di una coppia di elettroni tra un atomo che può dare elettroni ed un altro atomo che avendo orbitali liberi, può accettarli;
4) Legame ionico: legame di natura elettrostatica in seguito allo scambio di elettroni di valenza tra due o più atomi;
5) Legame idrogeno: debole legame di natura elettrostatica che si presenta in numerose sostanze, tutte aventi idrogeno ed un altro elemento fortemente elettronegativo (O,F,N);
6) Forze di Van der Waals: debole legame che si stabilisce tra atomi e molecole che, privedi polarità propria, manifestano una polarità acquisita in seguito a temporanei squilibri della loro compagine elettronica.
Lacche
Una classe particolare di coloranti basici è rappresentata dalle lacche: cioè coloranti basici in cui l’auxocromo è un metallo. I metalli più usati nelle lacche per uso istologico sono alluminio, ferro e cromo.Il largo impiego delle lacche è giustificato dall’intensità e stabilità del colore.
Metacromasia
E’ un particolare comportamento di alcuni coloranti basici (blu di tolouidina, blu di metilene,Azur I e II, cristal violetto, blu brillante di cresile).Questo termine indica un cambiamento (o viraggio) del colore, una volta che il colorante sia stato assunto da determinate sostanze, definite perciò cromotrope. I coloranti metacromatici sono basici ed il colore proprio del colorante in soluzione diluita è detto ortocromatico.
La metacromasia non deve essere confusa con l’allocromasia dovuta alla distribuzione di determinati coloranti verso strutture tissulari o cellulari più affini, differenziando queste parti con un colore diverso da quello del resto del preparato.
Acidofilia e basofilia
Acidofilia: colorazione di molecole biologiche basiche (gruppi basici) con coloranti acidi.
Basofilia: colorazione di molecole biologiche acide (gruppi acidi) con coloranti basici.
Modalità di esecuzione delle colorazioni
1) colorazioni in blocco: è una colorazione di frammenti di tessuti prima che sianosezionati (Cayal – Levaditi);
2) colorazioni di sezioni: è la colorazione che avviene dopo che il tessuto è stato sezionato (in automatico; in manuale);
3) colorazioni dirette: sono quelle in cui il preparato non richiede trattamenti particolari prima di essere immerso nella soluzione colorante;
4) colorazioni indirette: sono quelle in cui l’immersione nel bagno di colorazione deve essere preceduta da una mordenzatura;
5) colorazioni progressive (ad esempio l’ematossilina di Ehrlich, di Mayer e diHarris): hanno una concentrazione più bassa di colorante e colorano selettivamente la cromatina nucleare senza intaccare le strutture citoplasmatiche. L’intensità desiderata è in funzione del tempo.;
6) colorazioni regressive (ad esempio ematossilina di Harris, Giemsa o Papanicolau):
agiscono in modo intenso su tutte le strutture nucleari e citoplasmatiche. Per ottenere la risposta cromatica corretta, occorre rimuovere il colorante in eccesso dalla sezione di tessuto.
7) colorazioni semplici: si usa un solo colorante;
8) colorazioni complesse: si usa più di un colorante contemporaneamente o in successione l’uno dopo l’altro;
9) colorazioni vitali (ad esempio le cellule fagocitate in sospensioni colloidali di
anioni quali tripan blu, inchiostro di china): sono quelle applicate a cellule o animali viventi. Queste presuppongono l’intervento di processi vitali per l’assunzione delle molecole coloranti all’interno di cellule o nella sostanza intercellulare;
10) colorazioni sopravitali (ad esempio il verde Janus per mitocondri): quando il colorante è usato per trattare tessuti o cellule isolate, ancora vive, dopo l’allontanamento dell’animale di cui facevano parte.
Classificazione delle colorazioni
Le colorazioni, indipendentemente dal meccanismo d’azione del colorante, possono esseredivise in due gruppi:
1. colorazioni istomorfologiche (nucleo, citoplasma, tessuto epiteliale, collageno, ecc…);
2. colorazioni istochimiche (per mettere in evidenza le sostanze chimiche contenute nei tessuti e la loro posizione).
COLORAZIONI PANOTTICHE
Sono colorazioni ASPECIFICHE (o segnaletiche) che sfruttano la diversa affinità tintoriale delle strutture cellulari o extracellulari. Le colorazioni panottiche si distinguono da quelle denominate SPECIFICHE che sfruttano le caratteristiche chimico-fisiche o antigeniche delle cellule o tessuti e che permettono di evidenziare particolari molecole organiche o inorganiche, enzimi, microorganismi, sostanze immunogene e sequenze genomiche
COLORAZIONI ISTOLOGICHE
EMATOSSILINA EOSINA
(tessuto epiteliale di rivestimento di transizione) 
L’ematossilina (emalume, colorante basico) si lega con un legane non ben preciso a strutture con radicali liberi acidi .Colora, perciò in viola i nuclei delle cellule, il nucleolo,aree basofile nel citoplasma,la sostanza fondamentale della cartilagine.
L’eosina colora le struttura basiche di rosa. Evidenzia il citoplasma delle cellule e le fibre collagene
AZAN- MALLORY
(tessuto epiteliale di rivestimento cilindrico bistratificato)
Colorazione elettiva per evidenziare le fibre collagene del tessuto connettivo fibrillare. I coloranti usati in sequenza:
L’AZOCARMINIO che colora in rosso i nuclei delle cellule, gli eritrociti e in rosso tenue il citoplasma
LA MISCELA DI MALLORY (Blu di anilina, Orange G e acido ossalico) che colora in blu forte le fibre collagene, in azzurro le mucine. Le cellule del sangue e le fibre muscolari in arancio.
May-GRUNWALD-GIEMSA
E’una doppia colorazione utizzata per colorare gli strisci di sangue,
Il corretto funzionamento lo affronteremo quando parleremo dello striscio di sangue.
WEIGERT- VAN GIESON
(cartilagine)
Sono due colorazioni abbinate.Mediante la miscela di Weigert , contenente fucsina basica e resorcina,vengono colarate in nero le fibre elastiche; con la miscela di Van Giesono, contenente fucsina acisa e acido picrico, vengono colorate le fibre collagene in rosso magenta,mentre altre cellule (es cellule muscolari e del sangue) divengono giallo-arancio. Come colorante di contrasto per il nucleo è impiegata l’ematossilina ferrrica,che colora i nuclei in marrone-nero.
IMPREGNAZIONE ARGENTICA
(tessuto connettivo reticolare fegato)
Colorazione per il tessuto reticolare,in questa colorazione si utilizza un sale di metallo (ad esempio nitrato d argento) che viene depositato in alcuni componenti tissutali allo stato colloidale. In seguito il tessuto è sottoposto all’azione di una soluzione riducente e il metallo viene ridotto allo stato elementare. Si evidenziano cosi’ le fibre reticolari in marrone scuro e nero