TEST DIRETTI

Per ricercare in laboratorio gli antigeni eritrocitari ABO su campioni di sangue si utilizzano anticorpi specifici agglutinanti . Questi, nel passato, venivano ricavati dal siero di donatori umani portatori di alloanticorpi naturali o da animali sensibilizzati. Oggi sono prodotti in vitro, utilizzando particolari tecniche di ingegneria genetica. Queste tecniche consentono la produzione di anticorpi altamente specifici di una unica classe anticorpale e pertanto sono detti anticorpi monoclonali .

La determinazione classica del sistema gruppale ABO si effettua in laboratorio su vetrini. Per ogni determinazione si utilizzano tre vetrini su ciascuno dei quali si pone una goccia del sangue da testare ed una di fisiologica, sul primo vetrino poi si mette una goccia di siero test anti-A, sul secondo di anti-B, sul terzo di anti-A,B ricavato da un donatore di gruppo O.

Su ciascun vetrino si mescolano le tre componenti (sangue, fisiologica ed antisiero) si bascula per qualche minuto a temperatura ambiente e si legge per una agglutinazione che, se presente, è chiara e massiva. L’uso dell’antisiero anti-A,B da donatore O è motivato dalla maggiore avidità che questo siero presenta per l’antigene A e per le sue varianti genetiche (A1, A2, ecc.). L’agglutinazione del campione trattato con siero anti-A,B alla quale fa riscontro una agglutinazione ritardata e meno decisa del campione trattato col siero anti-A è caratteristica per le mutazioni dell’antigene A. Esistono in commercio agglutinanti aspecifici per l’antigene A1 di derivazione vegetale (lecitina).

La stessa determinazione si può effettuare in provetta ponendo una goccia di eritrociti da esaminare diluiti al 10% in fisiologica, una goccia di fisiologica ed una di antisiero. Si centrifuga la provetta a temperatura ambiente ed a 1000 giri per un minuto quindi si agita per valutare la presenza di agglutinazione o di emolisi.

Del tutto recentemente sono stati messi a punto dei particolari sistemi che semplificano e rendono più facile l’interpretazione dei tests per la determinazione dei gruppi sanguigni.

Queste metodiche utilizzano dei supporti contenenti delle colonnine contenenti all’interno una sostanza porosa inerte. Le emazie libere passano attraverso questi pori e sedimentano sul fondo delle colonnine. Se invece le emazie vengono messe nelle colonnine insieme ad antisieri gruppo specifici, qualora esse reagissero con gli anticorpi agglutinanti non potrebbero più passare attraverso i pori del supporto ed anche dopo centrifugazione della colonnina esse rimarrebbero impaccate sopra il gel.

La chiave interpretativa sta nel fatto che la resina o gel rappresenta una barriera non superabile per gli eritrociti aggregati in complessi da un antisiero specifico. Per cui la filtrazione e l’impaccamento delle emazie sul fondo della colonnina equivale alla mancata agglutinazione quindi alla negatività del test,mentre l’impaccamento alla superficie della resina equivale alla agglutinazione quindi alla positività del test.

Nella pratica le cose avvengono così:

sono disponibili in commercio dei supporti comprendenti un certo numero di colonnine Ognuna di queste colonnine contiene nella parte centrale una resina porosa inerte che è bagnata da un tampone. Ogni colonnina contiene poi rispettivamente siero anti-A, anti-B, anti-A,B, anti-D, anti-K mentre l’ultima contiene solo tampone.

Si aggiunge ad ogni colonnina una goccia diluita in tampone delle emazie da testare, si pone quindi il supporto in una apposita centrifuga quindi si procede alla lettura ed alla interpretazione. La provetta contenente solo tampone deve sempre presentare gli eritrociti completamente filtrati ed impaccati sul fondo. Qualora invece essa presentasse un impaccamento eritrocitario sulla superficie della resina bisogna sospettare la presenza di autoanticorpi patologici che devono essere opportunamente indagati. In tali casi comunque il test non è valido.

 TESST INDIRETTI

La determinazione diretta del sistema ABO ha la sua controprova nella ricerca nel siero degli alloanticorpi relativi.

Da quanto è stato detto sappiamo che soggetti con gruppo eritricitario A presentano specificità sierica anti-B, viceversa soggetti con eritrociti B hanno siero anti-A, soggetti con eritrociti O hanno siero anti-A,B, soggetti AB non presentano alloanticorpi

Nel siero, ad esempio, di soggetti con antigene A deve essere rinvenuto l’antigene anti-B. Ciò si dimostra in laboratorio utilizzando dei pannelli di eritrociti a composizione antigenica nota. In ognuna di due provette viene posta una goccia di eritrociti A e B e successivamente due gocce del siero del paziente. Le provette vengono quindi sottoposte a centrifugazione e lette per emolisi ed agglutinazione.

Se si ha agglutinazione per l’antigene A, il soggetto presenta anticorpi anti-A quindi avrà antigeni eritrocitari B. Se è positiva l’agglutinazione per il pannello eritrocitario B il soggetto sarà portatore di antigene A, se non ci sarà alcuna agglutinazione significa che il siero del soggetto non presenta alloanticorpi per cui le emazie saranno AB, infine se saranno agglutinate le emazie dei due pannelli test le il soggetto sarà di gruppo O in quanto nel siero sono presenti alloanticorpi anti-A ed anti-B.

Nelle varianti del gruppo A gli anticorpi anti-A sono assenti (come nei soggetti con antigene A normale), perciò nel caso di agglutinazione dubbia al test diretto, la negatività del test sierologico per la ricerca di alloanticorpi A è un chiaro indizio della presenza di antigeni A mutanti.

 DETERMINARE IN LABORATORIO FATTORE Rh

La determinazione degli antigeni del sistema Rh in laboratorio si realizza usando antisieri specifici per ciascun antigene. Il sistema Rh non è caratterizzato dalla presenza di alloanticorpi naturali. I sieri test vengono quindi ricavati da individui sensibilizzati per trasfusione impropria o da animali di laboratorio sensibilizzati.

Del tutto recentemente l’industria ha messo a disposizione degli anticorpi sintetizzati in vitro (anticorpi monoclonali). La reazione tra i sieri test e gli antigeni del sistema Rh è esaltata dalla presenza di albumina; ciò non avviene per la determinazione del gruppo ABO.

La determinazione degli antigeni del sistema Rh, nella normale routine di laboratorio, viene ridotta alla ricerca del più immunogeno degli antigeni, l’antigene D.

Nella pratica di laboratorio le emazie del paziente vengono testate con siero anti-D su vetrino (a caldo), in provetta, o sulle colonnine con resina porosa come detto per il sistema ABO.

Vengono definiti Rh positivi i soggetti che presentano l’antigene D e negativi quelli che non lo presentano. La determinazione del fenotipo Rh ha grande importanza oltre che per le pratiche trasfusionali, per individuare le donne Rh negative coniugate con un D positivo. Queste donne, qualora il feto fosse D positivo, vanno accuratamente monitorate perché, nel corso della gravidanza, possono sensibilizzarsi verso il D e danneggiare il feto più o meno gravemente. Nel corso del parto è frequente che le emazie del feto passino nel circolo della madre. Ciò potrebbe sensibilizzare la donna e costituire un grave pericolo per future gravidanze con prodotto del concepimento D. Per ovviare a questo pericolo da oltre un decennio alle donne Rh negative che partoriscono figli D positivo entro 72 ore dal parto si somministrano per via intramuscolare delle immunoglobuline anti-D che hanno lo scopo di distruggere eventuali emazie del figlio presenti nel sangue della madre prima che questa venga sensibilizzata.

(DISPENSA DEL CORSO PER ESAMI DI STATI)