INTRODUZIONE

E’ nell’esperienza comune distinguere i diversi colori e per ciascun colore la diversa intensità. Nel laboratorio di analisi cliniche l’esatta misurazione dell’intensità del colore di una soluzione è un’operazione basilare.Essa consente dosaggi sufficientemente precisi della concentrazione di metaboliti ed enzimi nei liquidi organici. Per tale motivo la FOTOMETRIA è uno degli argomenti fondamentali di ogni corso di tecnica e diagnostica di laboratorio.

 LA LUCE ED IL COLORE

La luce è una radiazione elettromagnetica che si muove nello spazio con un andamento ondulatorio, cioè formando delle onde

L’onda ammette una rappresentazione sinusoidale (fig. 1).

Essa è caratterizzata da due elementi fondamentali, la lunghezza e l’ampiezza.

L’ampiezza  è proporzionale alla carica energetica (simbolo E) che l’onda trasporta (quindi all’intensità luminosa).

La lunghezza  è data dalla distanza tra due cicli ( come è evidente ogni ciclo è costituito da due fasi una positiva l’altra negativa).

La lunghezza d’onda è inversamente proporzionale alla frequenza della radiazione elettromagnetica. Questa esprime il numero di cicli d’onda per unità di tempo ed è intuitivo che minore è la lunghezza dell’onda maggiore sarà il numero di cicli per secondo.Il potere di penetrazione di una radiazione luminosa è direttamente proporzionale alla frequenza di questa. Pertanto le radiazioni a frequenza più elevata saranno più penetranti. La luce visibile (cioè capace di produrre la sensazione luminosa stimolando le cellule della retina dell’occhio umano) ha una lunghezza d’onda compresa tra 400 e 700 nm (millesimi di millesimo di millimetro).Al di sotto dei 400 nm (regione dell’ultravioletto) l’occhio umano non percepisce sensazioni luminose (i fotometri, invece, riescono ad effettuare tra i 290 ed i 400 nm dosaggi precisi e preziosi per il chimico clinico).All’estremo opposto dello spettro, cioè oltre i 700 nm (regione dell’infrarosso) le radiazioni non producono colore, bensì calore (sono cioè radiazioni termiche).All’interno dello spettro visibile (vedi tab. 1) osserviamo la luce bianca ed i colori.

                    Tab. 1

La sensazione del colore è data dalla stimolazione prodotta sulle cellule della retina da radiazioni di specifica, ristretta e diversa (per ciascun colore) lunghezza d’onda.Il colore è dunque funzione della lunghezza d’onda della radiazione che colpisce l’occhio.Un fascio luminoso costituito da una miscela di radiazioni di diverse lunghezze d’onda da una luce policroma. Un fascio luminoso costituito da radiazioni di una stessa ristretta lunghezza d’onda è detto monocromatico.

La luce bianca (cioè quella prodotta da una normale lampada da illuminazione, o la stessa luce solare – con una approssimazione che esclude la spiegazione delle bande di assorbimento di Fraunofer) è un caso particolare di luce policromatica costituita da una equilibrata ed armonica miscela di tutte le radiazioni luminose monocromatiche rappresentate nell’arcobaleno (colori dell’iride).

SCOMPOSIZIONE DELLA LUCE BIANCA  MONOCROMATORI

 Facendo passare un fascio di luce bianca attraverso un prisma di cristallo (fig. 2), questa viene scomposta nei fasci di luce cromatica elementari costituenti. Il prisma è pertanto uno strumento semplice capace di scomporre la luce bianca nei colori componenti. Esso è quindi un MONOCROMATORE, cioè uno strumento capace di produrre fasci di luce di singoli ben definiti colori.Ad ogni colore corrisponde una determinata lunghezza d’onda della radiazione luminosa (tab. 2). Quindi i monocromatori riescono a selezionare le radiazioni elettromagnetiche nello spettro del visibile (tab.1) in base alla lunghezza d’onda di queste.

                          Tab. 2

Come dicevamo, una sorgente di luce bianca può essere scomposta nelle sue componenti principali per mezzo di un prisma o di un reticolo interferenziale (lastra di materiale trasparente nella quale sono state fatte dei solchi paralleli sottilissimi e molto ravvicinati). Questi strumenti fisici, sulla teoria dei quali non ci addentriamo, hanno quindi la capacità di scomporre la luce bianca nelle diverse componenti monocromatiche caratterizzate ciascuna da una lunghezza d’onda diversa.

Uguale risultato può ottenersi con dei filtri colorati. Questi, colpiti da un fascio di luce bianca, lasciano passare radiazioni di una specifica lunghezza d’onda riflettendo ed assorbendo le componenti cromatiche di lunghezza d’onda diversa. Anche i filtri sono quindi monocromatori, tuttavia essi non scompongono la luce nelle sue componenti (come i prismi) ma la filtrano soltanto. In questo caso non potremo scandagliare lo spettro in modo continuo dovendoci limitare a lunghezze d’onda definite.

I PRINCIPI DELLA FOTOMETRIA

 Quando un raggio luminoso attraversa una soluzione alcune molecole che hanno una configurazione chimica particolare (comprendenti di solito anelli ciclici e/o doppi legami) riescono a trattenere una radiazione luminosa di una specifica lunghezza d’onda. L’assorbimento di tale radiazione è tanto maggiore quanto più concentrata è la soluzione e quanto più ampio è il tragitto ottico che il raggio monocromatico deve percorrere Va dichiarato, a questo punto, un altro concetto chiave della fotocolorimetria: il concetto della complementarietà tra il colore della soluzione e quello della radiazione luminosa monocromatica meglio assorbita dalla soluzione colorata stessa.

Ad ogni colore della soluzione da misurare corrisponde quindi un colore complementare che viene selettivamente e specificatamente assorbito dalla soluzione stessa.

Tale complementarietà è espressa nel cosiddetto CIRCOLO CROMATICO DI OSTWALD

E’ chiaro che se la misurazione fotometrica deve valutare l’attenuazione per assorbimento da parte della soluzione colorata di una luce incidente è necessario per la precisione della misura stessa, che la luce incidente sia monocromatica.Ciò impedirà che la luce di altre lunghezze d ‘onda diversamenteassorbita o riflessa dalla soluzione colpisca la fotocellul DI LETTURA PORTANDO A RISULTATI NON LINEARI, QUINDI NON VALUTABILI.

In conclusione solo con un fascio di luce monocromatica complementare l’assorbimento luminoso può essere reso proporzionale all’intensità del colore della soluzione da analizzare