L’istologia studia la morfologia dei tessuti, e le cellule che li compongono, sia da un punto di vista morfologico che funzionale. Strumento essenziale per l’istologia è il microscopio, che permette l’osservazione diretta dei tessuti che si vogliono studiare. Perché tale osservazione sia possibile, tuttavia, questi devono essere lavorati e trattati in vari modi: devono essere tagliati in strisce sottilissime, così da poter essere osservati in controluce, devono essere colorati in vari modi, così da poter essere più facilmente riconoscibili e distinguibili, e devono infine essere trattati in modo da prevenirne la decomposizione e permetterne la conservazione per analisi successive. Un tessuto che sia stato in questo modo trattato prende il nome di preparato istologico

Questo preparato biologico quindi prima di essere definito tale deve sottoporsi a diverse fasi, vediamo quali:

FISSAZIONE:una volta estrapolato il tessuto che ci interessa esaminare, la prima cosa che bisogna fare eseguire l’immersione in un liquido fissativo (formaldeide 4%, paraformaldeide 4% la glutaraldeide, il tetrossido di osmio ecc.).

La fissazione serve a bloccare le attività vitali della cellula, rendendo insolubili i componenti strutturali, stabilizzando le proteine e inattivando gli enzimi idrolitici

LAVAGGIO: per togliere il fissativo in eccesso (soluzione tampone fosfato salino)

DISIDRATAZIONE: si pongono 4 contenitori (vascette , becher) dove si inseriscono degli alcool in scala ascendente (ALCOL ETILICO, 70°, 80°, 90°E 100°), questo serve per eliminare la componente acquosa, che non permetterebbe l’entrata della paraffina nel tessuto.

DIAFANIZZAZIONE:in solventi della paraffina (TOLUOLO, BENZOLO, XILOLO) che rendono il pezzo già privato dell’acqua,diafano(trasparente) e penetrabile da parte della paraffina(lo xilene permette la sostituzione dell’alcol assoluto non miscibile con la paraffina).

INFILTRAZONE: In paraffina fusa a 60° (stufa,tarata secondo il punto di fusione della paraffina fra 58° e 60°) per permetterle di sostituirsi allo Xilene , all’ interno del pezzo istologico.

INCLUSIONE: l’inclusione viene effettuata in paraffina a temperatura ambiente in modo che questa solidifichi. La durezza della paraffina solida ci permette di realizzare le sezioni istologiche. (LICCARE SULL’IMMAGINE VE LA PORTA INGRANDITA)

PROCEDURE PER IL TAGLIO

P=PREPARATO

M=MANOVELLA

L=LAMA

S=SEZIONE

Dopo aver riconosciuto nel blocchetto la superficie secondo la quale si desidera affettare il campione, e dopo aver tolto l’eccesso di paraffina, si monta il blocchetto sul portablocchetto facendolo aderire con un po’ di paraffina fusa grazie alla spatolina riscaldata sul bunsen.

 Si sagoma, con la spatolina, il blocchetto di paraffina in modo da completare la suasaldatura al portablocchetto.

  Dopo che si è raffreddato, il blocchetto si alloggia nell’apposita torretta portapezzo  del microtomo

 Si alloggia la lama nel supporto apposito del microtomo

Si avvicina la torretta con il preparato al filo della lama, facendo dapprima uso dei comandi meccanici che regolano gli spostamenti grossolani (ad esempio facendo scorrere il supporto portalama verso il preparato) , quindi facendo uso dei comandi elettrici. Con tali manovre si intende avvicinare il pezzo da tagliare al filo della lama. Una volta ottenuto ciò, si completa l’avanzamento mediante rotazione del volano.

Dopo aver ottenute le prime “fette”, soprattutto se si è vicino al pezzo incluso nel blocchetto, ci si arresta. A questo spunto si squadra la superficie di taglio del blocchetto e si regola lo spessore delle sezioni.

 In assenza di problemi si ottiene un nastro diritto che successivamente potrà essere, con l’ausilio dei pennellini, staccato dal filo della lama e poggiato sul cartoncino scuro

 I nastri, raccolti vengono suddivisi in tanti segmenti con l’ausilio della lametta.

 Si etichettano i vetrini sulla parte smerigliata, con un codice che riporta dati sul pezzo che si sta affettando e su ognuno di essi si pone la soluzione adesiva di albumina glicerinata

 Si adagia, con l’ausilio dei pennellini, uno o più segmenti del nastro di paraffina sul vetrino recante albumina glicerinata.

Si adagia il vetrino recante i nastri di paraffina sulla piastra termostatabile, facendoattenzione che la temperatura della piastra non superi mai la temperatura di fusione della paraffina utilizzata per l’inclusione (è preferibile, anzi, qualche gradocentigrado in meno). Per effetto del calore, l’acqua della soluzione adesiva sidistende e con essa anche i nastri di paraffina che vi galleggiano sopra (per tensione superficiale) 

 Ottenuta una valida distensione (il nastro di paraffina deve apparire traslucido e ilpreparato deve essere ben evidente) si allontana la soluzione acquosa per cui le fette aderiscono al vetrino.

 I vetrini vengono posti nella stufa a 37°C affinché si asciughino completamente. Le sezioni in paraffina in paraffina aderenti sui vetrini porta oggetti affinchè possano essere colorate con coloranti istologici, debbano  prima subire i seguenti passaggi:

DEPARAFFINAZIONE: con toluolo o xilelne per allontanare la paraffina dalle sezioni istologiche.

REIDRATAZIONE: con la scala discendente degli alcol ( per ridare gradualmente acqua alla sezione )

LAVAGGIO: con acqua distillata

COLORAZIONE: viene eseguita la colorazione desiderata

Eseguita l’operaione di colorazione dei preparati le sezioni sono sottoposte:

DISIDRATAZIONE: mediante la scala ascendente degli alcol (alcol etilico 70°,80,°90°,100°)

CHIARIFICAZIONE:in solventi organici (toluolo o benzolo o xilele)

MONTAGGIO:con un vetrino copri oggetto con interposto una goccia di alcune resine naturali.